六种常用免疫组化染色方法【病理学吧】

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多种免疫规划化学作用办法,新办法层出不穷,如两踱,校正,与时俱进。但是这些办法各有标点,但总之,,免得拨的话,可以设法对付满足的坐果。。办法的选择缺陷心情免疫归结为的主要因素。问题是一个人单位应该是日常的的。、紧握方法运用一种办法,更迭运用确切的的办法或频繁的R是不拨的。。一旦选择了办法,强制把它恢复友好状态,试着让人使相对、二抗、帐单药剂和底物的浓度、培育工夫和浓度、缓冲喝酒的敷、使标准化。
1
SP法免疫组化染色
规律
Streptomycin avidin(SA)是从链霉素中使分开设法对付的一种蛋白质的质。,穿透规划的容量超越ABC。、PAP调和大,影响率快,它包括四声望单元。,每个亚基都有一个人与辅酶R贯的位点(辅酶R)。,二者私下有很强的密切关系。,SA的等电位在近处,近中性,抗辅酶R蛋白质的10,照着,SA与内源性凝集质的合身的异性接合差一点不相关。,Streptomycin avidin peroxidase缩小体系,可以发生低的环境。、高倍率效应。S-P采取辅酶R帐单的次要的对称体与链霉素抗辅酶R蛋白质的衔接的超氧化物酶及基质素混合物来测量细胞和规划中间的反日。
碱性染色法
1、白腊做切片对水的脱蜡;
2、3% H202在室温下孵育5~10分钟。,内源性超氧化物酶主动语态的距离;
3、蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,(比如,反日弥补的必要,可以在这一步后来停止。;
4、5~10%规则山羊浆液(PBS潮解)封锁,在室温下孵育10分钟。。浸渍浆液,勿洗,调配充分比率的潮解的一种或一种抗任务清澈的。,在37摄氏温度下孵育1~2小时或4摄氏温度。;
5、PBS冲洗,5分钟×3次;
6、潮解辅酶R帐单的两种抗潮解(1% BSA-PBS潮解),在37℃下孵育10~30分钟。;或二盐基的辅酶R帐单的两种抗任务清澈的,在37℃或室温下孵育10~30分钟。;
7、PBS冲洗,5分钟×3次;
8、Streptomycin(PBS潮解)用充分潮解的镶嵌地砖帐单。,在37℃下孵育10~30分钟。;次要的代山葵酶帐单的链长霉蛋白质的F,在37℃或室温下孵育10~30分钟。;
9、PBS冲洗,5分钟×3次;
10、Chromogenic代劳(DAB或AEC);
11、非蒸馏水完整冲洗,重染,封片。
附:冻做切片免疫组化染色程度
1、冻做切片4~8UM,室温后30分钟,在4℃时,丙酮紧握10分钟。,PBS洗,5分钟×3次。
2、培育3%强双氧水5~10分钟,内源性超氧化物酶主动语态的距离。
3、PBS洗,5分钟×2次。
4、下接白腊做切片免疫组化染色运算程度。
2
Ovalbumin -辅酶R超氧化物酶调和法
规律
这种办法是由于高密切关系的生物特点。,辅酶R率先与酶接合,辅酶R化山葵超氧化物酶的构成,辅酶R化HRP以必然比率与卵母细胞混合。,构成院子。具体程度列举如下:种别性对称体与规划中间的反日接合构成反日。。辅酶R化的两种抗特异对称体影响,之后添加ABC复合肌,反日 种别性对称体 辅酶R化的两种抗 卵清蛋白质的 辅酶R HR。终极DAB颜色夸大。
碱性染色法
1、做切片法脱蜡制水;
2、PBS洗濯5分钟2次;
3、木醇-H2O2 30分钟,37℃;
4、PBS洗濯5分钟2次;
5、规则家畜浆液20分钟,37℃;
6、种别性对称体潮解60分钟,37℃;
7、PBS洗濯5分钟2次;
8、辅酶R帐单物的充分潮解,30分钟,37℃;
9、PBS洗濯5分钟2次;
10、ABC不正常的忧虑30-60分钟,37℃;
11、PBS洗濯5分钟2次;
12、DAB颜色夸大,镜下把持;
13、苏木素衬染、脱水、易识破的、中性胶封上。
附:微波炉ABC法的具体运算
1、规定脱蜡:Xylene产生、每分钟10分钟,无水含酒精的饮料Ⅰ、每分钟10分钟;
2、将做切片放入具有PBS气体体的染色筒中。,微波炉弥补1分钟,凉的和设定室温;
3、高音的对称体对称体,微波炉弥补1分钟,孵育20分钟,PBS气体体冲洗3缸3分钟;
4、滴加次要的对称体,微波炉弥补1分钟,孵育10分钟,PBS气体体冲洗3缸3分钟;
5、第三对称体,微波炉弥补1分钟,孵育10分钟,PBS气体体冲洗3缸3分钟;
6、DAB颜色夸大,(显微镜下)音管黑色重现,蒸馏水水利。
7、苏木素衬染,氢氯酸醇差动的法,水洗,封片。
3
径直地法
规律
酶帐单的种别性对称体与接受器径直地接合。,再与酶的底物功能发生彩色的的成果,反日对称体影响部位的堆积。
优点:简略、几步、省时、特强、光合身的异性染色;
错误:感受性差。
碱性染色法
1、做切片法脱蜡制水,PBS气体,5分钟洗濯;
2、1:20潮解规则浆液做切片20分钟;
3、酶标对称体的充分潮解,把它放在湿盒子里,37℃,30~60分钟;
4、PBS洗濯5分钟2次;
5、显色,镜下把持;
6、苏木素衬染、脱水、易识破的、中性树脂封上。
4
不坦率的法
规律
率先运用未帐单的种别性对称体(一种对称体)与C影响。,抗特异对称体帐单对称体与抗病毒液影响。
优点:办法便于使用的、响应速率比径直地法高;
错误:合身的异性染色。
碱性染色法
1、与径直地法相等的数量(1)~(2);
2、种别性对称体的充分潮解,4摄氏温度睡,或室温下30~60分钟。;
3、PBS洗濯5分钟2次;
4、滴加酶帐单对称体,室温30分钟;
5、后同径直地法。
5
酶桥法
规律
化学作用交联将对称体与对称体分子接合,染色后,种别性对称体与反日接合。,桥对称体与之接合。,抗酶对称体与桥对称体的接合,最后的,酶与酶对称体接合。,通行证底物的显色影响显示反日。。
优点:增殖办法的响应速率,光合身的异性染色;
错误:抗酶对称体必不可少的事物是高价钱、通行证高的洗净,不然,响应速率会蒸发。。
碱性染色法
1、规划做切片脱蜡制水,PBS洗濯5分钟2次;
2、用.。3% H2O2 -木醇在室温下做切片5~30分钟。;
3、全洗后,PBS洗濯5分钟2次;
4、1:20潮解规则浆液,室温30分钟;
5、PBS洗濯5分钟2次;
6、一抗,4℃,16~24小时;
7、PBS洗濯5分钟2次;
8、二抗,室温30分钟,PBS洗濯5分钟2次;
9、抗酶对称体,室温30分钟,PBS洗濯5分钟2次;
10、超氧化物酶喝酒的功能30分钟,PBS完整洗涤;
11、DAB-H2O2液显色5~30分钟,镜下把持;
12、同样的事物径直地法。
6
Peroxidase peroxidase复形法(PAP法)
规律
PAP法的基本规律与酶法鸟的基本规律相等的数量。,刚才用酶和对称体制成的免疫调和(PAP)替代了酶桥法中间的抗酶对称体和随后接合的酶,两步合成一步。
优点:响应速率比不坦率的法高20倍。;
错误:理论地说,PAP是一个人调和。,因它缺陷抗HRP对称体,不克不及与HRP接合,无环境上色,但在实践任务中仍在比得上重的合身的异性环境染色。
碱性染色法
1、规划做切片脱蜡制水;
2、H2O2 -木醇在室温下做切片5~30分钟。;
3、全洗后,PBS洗濯5分钟2次;
4、1:20潮解规则浆液,室温30分钟;
5、加一反(兔),在4℃下影响13~24小时;
6、PBS洗濯5分钟2次;
7、绵羊对兔IgG的添加,室温30分钟,PBS洗濯5分钟2次;
8、添加PAP,室温30分钟,PBS洗濯5分钟2次;
9、用DAB颜色夸大5~30分钟;
10、苏木素衬染、脱水、易识破的、中性胶封上。

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